In silico

Finantat de UEFISCDI prin Contractul 181/2011

SUMAR

In majoritatea proceselor biologice la nivel molecular, de la cele de recunoastere la cele de procesare a ADN-ului, domeniile proteinelor joaca un rol esential prin capacitatea lor de asociere in ansambluri supramoleculare permanente sau tranzitorii formate fie doar intre ele, fie cu alte molecule biologice [1]. De aceea, problematica arhitecturii si dinamicii proteinelor modulare si cea a relatiei structura-functie in ansamblurile supramoleculare au devenit in ultima vreme arii de cercetare de mare relevanta in biologia structurala [2].

Experimental, arhitectura proteinelor modulare si a structurilor supramoleculare alcatuite din proteine si/sau acizi nucleici poate fi probata printr-un mare numar de tehnici precum cristalografia de raze X, spectroscopia RMN, microscopia electronica, imprastierea de raze X sau neutroni in solutie [3]. Cu toate acestea, primele doua tehnici amintite sunt costisitoare, consumatoare de timp, si de multe ori limitate ca dimensiune a sistemului investigat; in timp ce urmatoarele prezinta un grad ridicat de eroare sau descriu sistemul la rezolutii foarte scazute.

Alternativ, un efort tot mai mare in investigarea ansamblurilor moleculare a fost dedicat in ultimul timp dezvoltarii de metode numerice, mai putin costisitoare, precum docking-ul molecular [4]. In ciuda progreselor evidente, aceste metode sunt inca in stare de dezvoltare incipienta datorita in primul rand slabei calitati a campurilor de forta ce nu pot distinge cu precizie soluia corecta intre multiplele solutii alternative [5].

In multe situaii acest neajuns poate fi surmontat atunci cand modelarea este folosita in combinatie cu constrangeri derivate din analiza bioinformatica a secventei si structurii si/sau cu constrangeri derivate din date experimentale precum FRET, spectrometria de masa etc. In astfel de cazuri puterea tehnicilor numerice de calcul in studierea ansamblurilor sau agregatelor poate creste considerabil. In acest context, prezentul proiect isi propune sa exploreze posibilitatea de a dezvolta strategii si unelte pentru asistarea in silico a activitatii experimentale legate de investigarea complexelor si ansamblurilor moleculare, pe care apoi sa le testeze in cat mai multe probleme de biologie structurala.

Dintre problemele la care metodologia dezvoltata va fi aplicata in acest proiect, o atentie speciala va fi acordata urmatoarelor trei directii: -a) investigarea interactiei proteina-proteina responsabila de arhitectura proteinelor de rezistenta la plante si de modul lor de recunoastere a efectorilor de la patogeni, recunostere care duce in final la un raspuns imun al plantei; -b) investigarea interactiei proteina-proteina si proteina-ADN ce explica diferenta functionala a topoizomerazelor umane si a efectelor unor mutatii punctiforme ce au fost dovedite ca inductoare de efecte maligne diferentiabile in topo IIα & β; si -c) investigarea arhitecturii Complexului Pereche cu accentul pe studiul configuratiei ADN si a interactiilor proteina-proteina si proteina-ADN in acest complex tranzient.

Prima directie - legata de interactiile proteina-proteina responsabile de arhitectura proteinlor de rezistenta ale plantelor si complexarea proteinelor-efector de la patogen ce declanseaza raspunsul imun - prezinta un interes major pe plan mondial datorita importantei economice ridicate. Departamentul nostru a participat activ la elucidarea unor aspecte importante ale domeniului in cadrul proiectului european integrat FP6-BIOEXPLOIT (FOOD-CT-2005-513959), in care a coordonat pachetul de lucru 2.4 (WP2.4) dedicat modelarii probabiliste a structurii proteinelor corespunzatoare unor secvente genomice noi ce au fost dovedite a fi implicate in aceste interactii. Prin proiectul de fata ne propunem sa extindem aceste studii, in complementaritate cu activitatile colaborative asigurate de actiunea COST FA1208 "EFECTOM: Dezvoltarea unei rezistente de spectru larg a culturilor bazata pe cunostinte despre patogeni" care isi propune sa "organizeze o retea europeana robusta pentru coordonarea cercetarii in domeniul bazelor moleculare ale evolutiei patogenicitatii mediata de efectori, in scopul dezvoltarii unor strategii comune de largire a spectrului de rezistenta".

Interesul pe directia studiului bazelor structurale ale functionarii diferentiale a topoizomerazelor umane este strans legat de raspunsul diferit al acestor enzime la actiunea medicamentelor sau radiatiilor in tratamentul cancerului. Iar abordarea acestei probleme a izvorat din colaborarea cu echipa condusa de Prof. Ram Ganapathi de la Levine Cancer Institute din Carolina de Nord impreuna cu care am localizat prin modelare moleculara pozitia unor mutatii punctiforme importante in monomerii celor doua topoizomeraze - topoIIα/β. Ceeace ne propunem prin prezentul proiect este de a localiza aceste mutatii in structura dimerilor functionali de topoizomeraza si de a estima in ce masura aceste mutatii sunt implicate in dinamica interna a ansamblului molecular sau in recrutarea altor proteine pentru a forma ansambluri ce sunt responsabile in final de procesarea globala a ADN-ului. Vor fi abordate si aspecte legate de efectul modificarilor post-translationale asupra celor doua enzime sau efectul distributiei mutatiilor punctiforme pe suprafata sau in miezul proteinei, in contextul celular, asupra divergentei fenotipice dintre topoIIα/β.

A treia directie de interes major are ca obiect investigarea prin metode in-silico a aspectelor de biologie structurala legate de formarea complexelor RAG-ADN si este rezultatul colaborarii cu Laboratorul lui David Schatz de la Departamentul de Imunobiologie al Scolii de Medicina Yale. Experimente de FRET si sm FRET vor fi folosite in combinatie cu tehnici de modelare si simulare moleculara pentru a stabili relatii structurale in acest ansamblu supramolecular. In cadrul laboratorului partener cercetarea complexelor RAG-DNA este sustinuta de grantul NIH 4R37 AI032524-21 (2012-2017) in care DBSB este implicat in calitate de colaborator. In acest context, prezenta aplicatie isi propune sa complementeze grantul NIH cu efortul de a dezvolta metode de modelare cu constrangeri experimentale in complexele RAG-ADN.

Referinte
1. Ban, Engelman, "Struct of Large Cellular Assemblies", Curr.Op.Str.Biol, 20, 207-9 (2010)
2. Rey, Sundquist, "Macromolecular Assemblage", Curr.Op.Str.Biol, 21, 221-222 (2011)
3. Rey, Saibil, "Macromolecular assemblies", Curr.Op.Str.Biol, 19, 178-180 (2009)
4. Stein et al, "3D modeling of protein interactions", Curr.Op.Str.Biol, 21, 200-208 (2011)
5. Vajda, Kozakov, "Convergence in prot-prot docking", Curr.Op.Str.Biol, 19, 164-70 (2009)